前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，在全球，前列腺癌的发病率在男性所有恶性肿瘤中高居第2位，仅次于肺癌。免疫检查点分子转化生长因子受体II（TGFβRII）、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3（TIM3）与前列腺癌的细胞免疫抑制有关，因此免疫治疗作为一种新的治疗方法逐渐表现出巨大的前景。
CAR-T治疗又称嵌合抗原受体T细胞治疗，是将人的T细胞经过基因工程手段体外修饰改造后，回输患者体内，达到治疗疾病的目的。CAR-T疗法作为癌症的突破性治疗手段，一直以来备受业内外人士关注，随着国内第四款CAR-T产品获批上市，CAR-T疗法热度持续升温。
近日，皖南医学院第一附属医院（弋矶山医院）泌尿科和精准医学中心的部分研究人员在《International Immunopharmacology》期刊上发表了题目为 “Dominant negative TGFβ receptor II and truncated TIM3 enhance the antitumor efficacy of CAR-T-cell therapy in prostate cancer” 的研究论文。该研究发现DT-PSMA-CAR-T细胞显示出根除PSMA阳性的前列腺癌细胞的能力。此外，在体外移植GAL9-PSMA-PC3 细胞的免疫缺陷型小鼠实验中，DT-PSMA-CAR-T细胞也显示出消除肿瘤组织的能力，延长生存期，没有显著的副作用。
图片来源：《International Immunopharmacology》
该项研究中，研究人员从健康供者的PBMC中进行了T细胞的纯化和扩增，其中培养T细胞使用的细胞因子IL-7、IL-15、IL-21和激活T细胞的试剂CD3单抗、CD28单抗由同立海源提供。此外，研究人员还用到了TGF-β和TIM3激活单克隆抗体等。
作者进行了CAR-T细胞的培养扩增、转导实验、肿瘤杀伤实验、WB、细胞流式检测、QPCR、细胞因子分析和动物实验等多种方法来证明CAR-T细胞能有效消除免疫抑制作用。
图1 CAR-T细胞的生产
首先，作者进行了CAR-T细胞的培养扩增并对其进行了表型分析。分为(i)UTD T细胞，(ii)PSMA-CAR-T细胞和(iii)DT-PSMA-CAR-T细胞。电穿孔后T细胞的扩增，质粒的插入对T细胞的扩增有影响。检测了分选后的T细胞上TIM3和TGFβRII的表达情况，三组T细胞的CD4和CD8表型，以及代表记忆T细胞的标记物CD45RO。总的来说，三组T细胞的表型是相似的。
图2 DT-PSMA-CAR-T的制备及表型鉴定
作者分别研究了三组T细胞对TGFβRII和TIM3单独作用及TGFβRII和TIM3联合应用后的抗肿瘤效率。
结果如下：
（1）DT可在体外消除TGFβRII对T细胞的抑制作用
在TGF-β浓度分别为0ng/ml和5ng/ml时，PSMA-CAR-T组和DT-PSMA-CAR-T组的肿瘤杀伤率相似（P>0.05）。在TGF-β浓度为20ng/ml和50ng/ml时，PSMA-CAR-T组的肿瘤杀灭率低于DT-PSMA-CAR-T组，在T细胞与靶细胞比例为1:1和5:1时差异更显著（P≤0.05）。
图3 不同TGF-β浓度对三组T细胞肿瘤杀伤效果对比
（2）DT可以消除TIM3对T细胞的抑制作用
在TIM3激活单克隆抗体浓度为10μg/ml和20μg/ml时，PSMA-CAR-T组的肿瘤裂解率低于DT-PSMA-CAR-T组，这与TGFβRII对T细胞的体外实验影响相似。在T细胞与靶细胞比例为1:1和5:1时，差异更为显著（P≤0.05)。
图4 不同TIM3单抗浓度对三组T细胞肿瘤杀伤效果对比
（3）DT可以消除TGFβRII和TIM3对T细胞的抑制作用
TGFβRII和TIM3之间存在协同效应。当TGF-β和TIM3激活单克隆抗体联合使用时，PSMA-CAR-T和UTD组对T细胞的抑制作用明显强于TGF-β或TIM3单独激活单克隆抗体（P≤0.05）。
图5 TGFβRII和TIM3联合使用对三组T细胞肿瘤杀伤效果对比
将DMEM-PSMA-PC3细胞皮下接种于小鼠背部。2周后，将所有小鼠随机分为三组，分别静脉静脉注射（尾静脉）：(i)UTD T细胞，(ii)PSMA-CAR-T细胞，(iii)DT-PSMA-CAR-T细胞。共观察1个月，采用脊髓脱位法观察未死于肿瘤的小鼠。每周通过腹腔注射荧光素进行生物荧光成像，并使用Aniview100（bolteng仪器）定量发光。
根据生物发光成像结果，UTD组有1只小鼠在T细胞输注后存活28天，而CAR-T组的所有小鼠均存活。
图6 DT-PSMA-CAR-T肿瘤杀伤体内实验
实验结果表明，在T细胞上过表达trTIM3和dnTGFβRII可以缓解TIM3和TGFβRII的免疫抑制作用，并在一定程度上改善了PSMA-CAR-T细胞的功能。作者认为靶向多个抑制性免疫检查点是提高细胞免疫治疗疗效的一种方法，该策略有利于难治性和复发性肿瘤患者，促进细胞免疫治疗产品的临床应用。
参考文献：
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3. K. Nakamura, S. Yagyu, S. Hirota, A. Tomida, M. Kondo, T. Shigeura, A. Hasegawa, M. Tanaka, Y. Nakazawa, Autologous antigen-presenting cells efficiently expand piggyBac transposon CAR-T cells with predominant memory phenotype, Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 21 (2021) 315–324.
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