人牙髓间充质干细胞(hDPSCs)是临床治疗中较好的细胞来源，具有高增殖能力、多向分化潜能、免疫调节能力等多种优点，hDPSCs一般在含有胎牛血清(FBS)的培养基中进行分离和扩增，但是出于安全性的考虑，迫切需要在符合标准生产规范(GMP)的环境下进行培养，所以选择一款不含血清的培养基并评价其性能将是至关重要的。
小编今天将带领大家对比一下符合GMP的无异种血清培养基(AMMS®MSC试剂盒套装2.0，AS-13）与含血清培养基(SCF)培养hDPSCs的效果差异。
人牙髓间充质干细胞(hDPSCs)来源于9颗正畸牙齿(杭州口腔医院正畸科)，hDPSCs分别平行在两种培养基中进行分离与培养，主要通过实验：集落形成单位(CFU)试验、流式细胞仪免疫表型分析、三系分化分析、神经细胞定向分化试验、荧光倒置显微镜观察、实时聚合酶链反应、SA-β-gal分析等实验系统比较了这两种培养基的细胞特性，包括形态、增殖、标记表达、分化、干细胞、衰老和细胞因子分泌等各项指标。
在两种培养基中传代培养的hDPSCs粘附在培养皿的底部，并显示出典型的纺锤形形态，但AMMS的细胞更细长，P1代SCM和AMMS培养的细胞PDT分别为28.11±4.50h和28.55±3.10h(p=0.625)。随着传代的进行，两种培养基中细胞的PDT逐渐增加，SCM中细胞的PDT增加更快。到P5时，SCM中细胞的PDT显著升高。侧面说明显示AMMS有更高的分离成功率。
CFU形成是细胞系增殖或自我更新能力的良好指标。在这项研究中，我们计算了P2和P5的hDPSCs形成的细胞集落数。分析表明，在SCM和AMMS培养的hDPSCs之间，以及在相同培养基中培养的P2和P5的hDPSCs之间，CFU形成率没有显著差异。在SCM中培养的细胞形成的集落更立体和聚集，而在AMMS中培养的细胞形成的集落扁平、松散和更大。这可能表明在AMMS培养的细胞具有更高的增殖能力。
根据ISCT对骨髓间充质干细胞的定义，我们用流式细胞仪检测了P2和P5的hDPSCs的免疫表型，包括CD73、CD90、CD105、CD45、CD14、CD19、CD34、HLA-DR，>95%，几乎不表达CD45、CD14、CD19、CD34和HLA-DR<2%。统计分析显示，在SCM和AMMS中培养的细胞之间的表达百分比没有显著差异(所有p> 0.05)，以及在相同培养基中培养的P2和P5的细胞之间没有差异。
SCM和AMMS培养的hDPSCs免疫表型标志物的表达，阴性对照(绿色)，人类牙髓干细胞；
SCM:含血清培养基； AMMS:无血清/异种培养基（同立海源生物）
干性保持是评估细胞质量和细胞制造过程适用性的一个很好的特征。在这里通过实时PCR检测多潜能标记基因的表达NANOG、OCT4和SOX2。P2和P5的细胞在SCM和AMMS培养的细胞中，这三种基因的表达都没有表现出任何差异。然而培养至P5时，确实导致了SCM中SOX2的表达(p=0.002)。这些结果可能反映了当细胞在AMMS培养时，干细胞保持得稍好。通过基于SA-β-gal活性的染色来检测扩增期间的细胞衰老，检测表明衰老细胞的比例很低(SCM:9.92±2.54%；AMMS:10.03±2.81%)。
分析干细胞相关基因(NANOG，OCT4，SOX2)的表达和传代培养过程中的细胞衰老
(a) 在P2和P5的SCM和AMMS中培养的细胞之间的相对mRNA表达比较(在P2的SCM中培养的不同基因的表达作为对照)；
(b) SA-β-GAL染色(蓝色细胞表示衰老)；
(c) 当在SCM中培养时SA-β-gal阳性细胞与总细胞的比率与P5时AMMS的比较(p=0.97)(比例尺=200微米)；
SCM:含血清培养基； AMMS:无血清/异种培养基（同立海源生物）
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测P5细胞分泌的细胞因子，包括HGF、FGF2、BDNF、GDNF、IL-6、IL-10、PGE2和TGFβ1。结果显示，与SCM培养的细胞相比，AMMS培养的细胞HGF的表达较高，而PGE2和TGFβ1的表达较低。这些数据表明，与SCM中分离的hDPSCs相比，在AMMS分离的hDPSCs表现出更高的增殖和自我更新能力。
许多研究证明了hDPSCs向骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化能力.茜素红染色显示，在两种培养基中培养的hDPSCs在诱导后显示出大量的矿物质沉积，但是成骨标记物(ALP和RUNX)是在AMMS扩大的hDPSCs中检测到的。与先前的研究一致，在SCM中培养的hDPSCs显示出有限的成脂分化潜能，但在AMMS扩增的hDPSCs表现出更明显的脂滴染色和更高的标记基因(LPL和PPARγ)成脂诱导下的表达。总的来说，在AMMS扩增的hDPSCs比在SCM中扩增的显示出更高的成骨和成脂潜能。
P5时在SCM和AMMS中培养的hDPSCs的三系分化潜能
(a)分别用茜素红、油红O和阿利新蓝染色显示hDPSCs的成骨、成脂和成软骨能力；
(b)成骨相关基因(ALP，RUNX2)的相对mRNA表达水平；
(c)成脂相关基因(LPL，PPARγ)的相对mRNA表达水平；
(d)软骨形成相关基因(ACAN，SOX9)的相对mRNA表达水平(比例尺=200微米，*p<0.05)；
人类牙髓干细胞；
SCM:含血清培养基； AMMS:无血清/异种培养基（同立海源生物）
所以综合来看，相比SCM，AMMS更有优势，并且在现行的管理体系下，无血清培养基替换含血清培养基是大势所趋，不仅提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响，减少了由血清带来病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险、血清中某些因素对有些细胞的毒性、血清中蛋白对某些生物测定的干扰，更有利于对实验结果的分析等等。
同立海源AMMS® MSC试剂盒套装2.0，适用于原代及冻存间充质干细胞的培养扩增，成分明确，稳定性高，操作简单，无需添加谷氨酰胺，无血清，无异源成分，扩增效率高，表型稳定。产品已通过美国FDA的DMF备案(035589)，干细胞药物临床实验最佳选择。
参考文献：
1. JUAN LI, XUEWEI LV, TINGTING GEC, JIAMAN SHI,GIDEON VERWOERD,HAIYAN LIN and YUANSONG YU, Improved Cell Properties of Human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) Isolated and Expanded in a GMP Compliant and Xenogeneic Serum-free Medium.
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